mohamedbac
2011-03-26, 20:17
الإنزيمات:
الانزيمات هى اكثر الجزيئات كبيرة الحجم التى تنتجها الميكروبات تنوعا. وهذه العوامل المساعدة البيولوجية هامة جدا فى الصناعات الغذائية والكيميائية نتيجة لتخصصها وكفاءتها العالية تحت الظروف المعتدلة من الحرارة والحامضية، ومع أن الانزيمات كانت تستخلص فى الماضى من النباتات والحيوانات إلا أن إنتاجها بواسطة الكائنات الدقيقة يزداد بسرعة كبيرة لسهولة عزلها وتحسين انتاجها إما عن طريق التعامل مع جيناتها او البيئة التى تنمو بها . بالإضافة الى ذلك ففى إنتاج الانزيمات بواسطة الكائنات الدقيقة عادة ما يكون زمن التخمر قصيرا والوسط الغذائى غير مكلف. ومن التطبيقات الحديثة للانزيمات المستخلصة من الكائنات الدقيقة يمكن أن نذكر استخدام إنزيمات الاميليز فى صناعات التخمر والخبز والنسيج . واستخدام إنزيمات البروتيز فى التخمر وتطرية اللحوم وفى صناعة المنظفات الصناعية واستخدام الرنين فى صناعة الجبن .
بعض الإنزيمات البكتيرية مثل تلك المشتقة من Bacillus subtilisأقل تأثراً بالحرارة عن الإنزيمات ذات الأصول الفطرية مثل Aspergillus oryzae. فمثلاً نجد أن بعض مستحضرات الأميليز المحضرة عن طريق عمليات تخمر ميكروبى باستخدام أنواع مختلفة من جنس Bacillus تحمل الحرارة التى وصلت لدرجة الغليان لفترة قصيرة ويكون نشاطها الأمثل فى المدى من 70-80×° وقد وجد أن حوالى 85% من نشاط إنزيم الألفا أميليز المنتج بواسطة Bacillus subtilis يتحمل درجات الحرارة العالية. إلا أن إنزيمات الأميليز المنتجة بواسطة الفطرة A. oryzae تفقد أكثر من 90% من نشاطها عند درجات الحرارة العالية. كما اتضح أن حفظ هذه المستحضرات الإنزيمية بصورة جافة يزيد من مقاومتها للظروف البيئة مثل درجة الحرارة.
· الفا اميليز amylaseα
a-Amylase
a-Amylase
Starch
--->
Oligosaccharides
--->
Maltose + Glucose
ومن التطبيقات الحديثة أيضا يمكن ذكر استخدام خليط من ثلاث انزيمات تنتجها الميكروبات هى الفا اميليز α- amylaseالذى يعمل على النشا منتجا الدكسترينات والمالتوز، و اميلو جلوكوزيديز Amylglycosidase الذى ينتج الجلوكوز مباشرة من النشاو Maltase المالتيز الذى يحلل المالتوز الى جلوكوز. وتستخدم هذه الانزيمات لتحضير شراب من الذرة ومن نشا القمح ولاستبعاد النشا من عصير الفاكهة لانتاج مشروبات الى حد ما خالية من العكارة.
· جلوكوز ايزوميريز Glucose isomerase
يمكن عزل هذا الانزيم من سلالات Bacillus & Arthrobacter ويمكن استخدامه للحصول على عامل تحلية عالى المحتوى من نشا الذرة.
· البروتيز Protease
ينتج بواسطة انواع بكتيرية مثل Bacillus subtilis & Bacillus licheniformis وتستخدم هذه الانزيمات فى دباغة الجلود وصناعة النسيج والحرير لنزع المواد الصمغية بروتينية الاصل والتى تحيط بالالياف الطبيعية.
التعريف: تقنيات تتجلى في عزل مورثة ذات منفعة من خلية ونقلها إلى خلية عائلة بهدف تغيير هذه الخلية وراثيا.
I - كيف يمكن ادن عزل مورثة من خلية ونقلها إلى خلية عائلة ؟ وما هي أدوات الهندسة الوراثية ؟
1- عزل المورثة المرغوب فيها
(ذات منفعة خاصة )
1-1- تجزيء ADN:
تذكر أن المورثة جزء من ADN وأن هذا الأخير متمو ضع داخل نواة الخلية.لبلوغ هذه المورثة لابد من هرس الخلايا والتخلص من الغشائين .
الخطوة المالية تتجلى في تجزيء ADN بهدف عزل المورثة المرغوب فيها: نستعمل لهذا الغرض نوع من الأنزيمات تعرف بأنزيمات الفصل. مثال أنزيم الفصل ECORI
بعض النماذج الأخرى من أنزيمات الفصل :المتتالية المرغوب فيها ليست مجهولة وبالتالي فأنزيم الفصل المناسب يتحدد حسب مواقع القطع المؤدية للمورثة
تذكر أننا نتوفر على معلومات كافية حول الجزء المبحوث عنه ضمن الأجزاء الناتجة عن تجزيء ADN.
في البداية لابد من فصل الأجزاء فيما بينها: نستعمل تقنية الهجرة الكهربائية Elèctrophorése .
بعد ذالك يتم فصل مختلف أشرطة الأجزاء فيما بينها ونسلط عليها ARN مجس (له القدرة الارتباط بجزء ADN المبحوث عنه)
1-2: النسخ العكسي: يمكن الحصول على المورثة المرغوب فيها كذلك من خلال ARNm باستعمال أنزيم خاص يعرف بأنزيم النسخ العكسي
نحصل على ADN أحادي اللولب بوجود النيكليوتيدات الأربع المكونة ل ADN وبوجود أنزيم البلمرة ADN polymérase نحصل على اللولب الثاني.
مثال: لنعتبر جزء من ARNm
بفضل أنزيم النسخ العكسي نحصل على ADN أحادي اللولب التالي
وبفضل أنزيم البلمرة ADN polymérase
2- تلميم المورثة المعزولة : لتفادي ضياع المورثة نقوم باستنساخها ( التلميم ) نستعمل لهذا الغرض تقنية PCR .
المبدأ: تدبدب الحرارة خلال دورة محددة بين 40 و90 درجة:
في حرارة 90 درجة ينفصل شريطي المورثة فيما بينهما (تلاشي الروابط الهيدروجينية)
في حرارة 40 درجة يقوم ADN polymérase ببلمرة شريطين جديدين وفق الآلية النصف
محا فضة (أنظر الآلية..........) نفس الدورة تتكرر عدة مرات نحصل على نسخ عديدة للمورثة.
3- دمج المورثة في الخلية العائلة:
هذه العملية تحتاج إلى وسيلة ناقلة : في الهندسة الوراثية نستعمل عادة البلاسميد Plasmide : عبارة عن جزيئة ADNحلقية توجد في سيتوبلازم البكتيرية
يتم فتح البلاسميد بواسطة أنزيم الفصل وبواسطة أنزيم الربط يتم دمج البلاسميد ( يشترط وجود أطراف موحدة بين كل من المورثة والبلاسميد)
يصبح البلاسميد مركب بعد دمجه للمورثة الدخيلة. يتم بعد ذلك إعادة البلاسميد المركب إلى البكتيرية العائلة بوجود ايونات الكالسيوم. بجوار المورثة البنيوية يتم دمج مورثة منظمة لعملها لكي يتم تعبير المورثة البنيوية.
4- زرع الخلايا العائلة في مخمرات صناعية:
تهدف هذه العملية إلى جعل الخلية المركبة تتكاثر بهدف إنتاج أكبر كمية من المادة الناتجة عن ترجمة المورثة المدمجة في البلاسميد .نوفر للخلايا المزروعة وسط زراعي أمثل .قبل زرع الخلايا لابد من التأكد من كونها تحتوي فعلا على البلاسميد المركب,نستغل لهذا الغرض خصائص البلاسميد قبل وبعد معالجته.
لاحظ أن البلاسميد المستعمل هنا يتميز بوجود مورثتين : Amp R (مقومة الأمبيسلين) و Tet R (مقاومة التتراسكلين) بعد دمجه للمورثة الجديدة فقد المورثة الأولى دون الثانية .ادن البكتيرية الحساسة لأمبيسلين والمقاومة لتتراسكلين هي من تتميز بتوفرها على البلاسميد المركب.
-II تطبيقات الهندسة الوراثية (في طور الانجاز)
1- في المجال الصيدلي: إنتاج الأنسولين.......
الانزيمات هى اكثر الجزيئات كبيرة الحجم التى تنتجها الميكروبات تنوعا. وهذه العوامل المساعدة البيولوجية هامة جدا فى الصناعات الغذائية والكيميائية نتيجة لتخصصها وكفاءتها العالية تحت الظروف المعتدلة من الحرارة والحامضية، ومع أن الانزيمات كانت تستخلص فى الماضى من النباتات والحيوانات إلا أن إنتاجها بواسطة الكائنات الدقيقة يزداد بسرعة كبيرة لسهولة عزلها وتحسين انتاجها إما عن طريق التعامل مع جيناتها او البيئة التى تنمو بها . بالإضافة الى ذلك ففى إنتاج الانزيمات بواسطة الكائنات الدقيقة عادة ما يكون زمن التخمر قصيرا والوسط الغذائى غير مكلف. ومن التطبيقات الحديثة للانزيمات المستخلصة من الكائنات الدقيقة يمكن أن نذكر استخدام إنزيمات الاميليز فى صناعات التخمر والخبز والنسيج . واستخدام إنزيمات البروتيز فى التخمر وتطرية اللحوم وفى صناعة المنظفات الصناعية واستخدام الرنين فى صناعة الجبن .
بعض الإنزيمات البكتيرية مثل تلك المشتقة من Bacillus subtilisأقل تأثراً بالحرارة عن الإنزيمات ذات الأصول الفطرية مثل Aspergillus oryzae. فمثلاً نجد أن بعض مستحضرات الأميليز المحضرة عن طريق عمليات تخمر ميكروبى باستخدام أنواع مختلفة من جنس Bacillus تحمل الحرارة التى وصلت لدرجة الغليان لفترة قصيرة ويكون نشاطها الأمثل فى المدى من 70-80×° وقد وجد أن حوالى 85% من نشاط إنزيم الألفا أميليز المنتج بواسطة Bacillus subtilis يتحمل درجات الحرارة العالية. إلا أن إنزيمات الأميليز المنتجة بواسطة الفطرة A. oryzae تفقد أكثر من 90% من نشاطها عند درجات الحرارة العالية. كما اتضح أن حفظ هذه المستحضرات الإنزيمية بصورة جافة يزيد من مقاومتها للظروف البيئة مثل درجة الحرارة.
· الفا اميليز amylaseα
a-Amylase
a-Amylase
Starch
--->
Oligosaccharides
--->
Maltose + Glucose
ومن التطبيقات الحديثة أيضا يمكن ذكر استخدام خليط من ثلاث انزيمات تنتجها الميكروبات هى الفا اميليز α- amylaseالذى يعمل على النشا منتجا الدكسترينات والمالتوز، و اميلو جلوكوزيديز Amylglycosidase الذى ينتج الجلوكوز مباشرة من النشاو Maltase المالتيز الذى يحلل المالتوز الى جلوكوز. وتستخدم هذه الانزيمات لتحضير شراب من الذرة ومن نشا القمح ولاستبعاد النشا من عصير الفاكهة لانتاج مشروبات الى حد ما خالية من العكارة.
· جلوكوز ايزوميريز Glucose isomerase
يمكن عزل هذا الانزيم من سلالات Bacillus & Arthrobacter ويمكن استخدامه للحصول على عامل تحلية عالى المحتوى من نشا الذرة.
· البروتيز Protease
ينتج بواسطة انواع بكتيرية مثل Bacillus subtilis & Bacillus licheniformis وتستخدم هذه الانزيمات فى دباغة الجلود وصناعة النسيج والحرير لنزع المواد الصمغية بروتينية الاصل والتى تحيط بالالياف الطبيعية.
التعريف: تقنيات تتجلى في عزل مورثة ذات منفعة من خلية ونقلها إلى خلية عائلة بهدف تغيير هذه الخلية وراثيا.
I - كيف يمكن ادن عزل مورثة من خلية ونقلها إلى خلية عائلة ؟ وما هي أدوات الهندسة الوراثية ؟
1- عزل المورثة المرغوب فيها
(ذات منفعة خاصة )
1-1- تجزيء ADN:
تذكر أن المورثة جزء من ADN وأن هذا الأخير متمو ضع داخل نواة الخلية.لبلوغ هذه المورثة لابد من هرس الخلايا والتخلص من الغشائين .
الخطوة المالية تتجلى في تجزيء ADN بهدف عزل المورثة المرغوب فيها: نستعمل لهذا الغرض نوع من الأنزيمات تعرف بأنزيمات الفصل. مثال أنزيم الفصل ECORI
بعض النماذج الأخرى من أنزيمات الفصل :المتتالية المرغوب فيها ليست مجهولة وبالتالي فأنزيم الفصل المناسب يتحدد حسب مواقع القطع المؤدية للمورثة
تذكر أننا نتوفر على معلومات كافية حول الجزء المبحوث عنه ضمن الأجزاء الناتجة عن تجزيء ADN.
في البداية لابد من فصل الأجزاء فيما بينها: نستعمل تقنية الهجرة الكهربائية Elèctrophorése .
بعد ذالك يتم فصل مختلف أشرطة الأجزاء فيما بينها ونسلط عليها ARN مجس (له القدرة الارتباط بجزء ADN المبحوث عنه)
1-2: النسخ العكسي: يمكن الحصول على المورثة المرغوب فيها كذلك من خلال ARNm باستعمال أنزيم خاص يعرف بأنزيم النسخ العكسي
نحصل على ADN أحادي اللولب بوجود النيكليوتيدات الأربع المكونة ل ADN وبوجود أنزيم البلمرة ADN polymérase نحصل على اللولب الثاني.
مثال: لنعتبر جزء من ARNm
بفضل أنزيم النسخ العكسي نحصل على ADN أحادي اللولب التالي
وبفضل أنزيم البلمرة ADN polymérase
2- تلميم المورثة المعزولة : لتفادي ضياع المورثة نقوم باستنساخها ( التلميم ) نستعمل لهذا الغرض تقنية PCR .
المبدأ: تدبدب الحرارة خلال دورة محددة بين 40 و90 درجة:
في حرارة 90 درجة ينفصل شريطي المورثة فيما بينهما (تلاشي الروابط الهيدروجينية)
في حرارة 40 درجة يقوم ADN polymérase ببلمرة شريطين جديدين وفق الآلية النصف
محا فضة (أنظر الآلية..........) نفس الدورة تتكرر عدة مرات نحصل على نسخ عديدة للمورثة.
3- دمج المورثة في الخلية العائلة:
هذه العملية تحتاج إلى وسيلة ناقلة : في الهندسة الوراثية نستعمل عادة البلاسميد Plasmide : عبارة عن جزيئة ADNحلقية توجد في سيتوبلازم البكتيرية
يتم فتح البلاسميد بواسطة أنزيم الفصل وبواسطة أنزيم الربط يتم دمج البلاسميد ( يشترط وجود أطراف موحدة بين كل من المورثة والبلاسميد)
يصبح البلاسميد مركب بعد دمجه للمورثة الدخيلة. يتم بعد ذلك إعادة البلاسميد المركب إلى البكتيرية العائلة بوجود ايونات الكالسيوم. بجوار المورثة البنيوية يتم دمج مورثة منظمة لعملها لكي يتم تعبير المورثة البنيوية.
4- زرع الخلايا العائلة في مخمرات صناعية:
تهدف هذه العملية إلى جعل الخلية المركبة تتكاثر بهدف إنتاج أكبر كمية من المادة الناتجة عن ترجمة المورثة المدمجة في البلاسميد .نوفر للخلايا المزروعة وسط زراعي أمثل .قبل زرع الخلايا لابد من التأكد من كونها تحتوي فعلا على البلاسميد المركب,نستغل لهذا الغرض خصائص البلاسميد قبل وبعد معالجته.
لاحظ أن البلاسميد المستعمل هنا يتميز بوجود مورثتين : Amp R (مقومة الأمبيسلين) و Tet R (مقاومة التتراسكلين) بعد دمجه للمورثة الجديدة فقد المورثة الأولى دون الثانية .ادن البكتيرية الحساسة لأمبيسلين والمقاومة لتتراسكلين هي من تتميز بتوفرها على البلاسميد المركب.
-II تطبيقات الهندسة الوراثية (في طور الانجاز)
1- في المجال الصيدلي: إنتاج الأنسولين.......