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Le séquençage d'un ADN, c'est à dire la détermination de la succession des nucléotides le composant, est aujourd'hui une technique de routine pour les laboratoires de biologie. Cette technique utilise les connaissances qui ont été acquises depuis une trentaine d'années sur les mécanismes de la réplication de l'ADN.
I- Le séquençage : présentation générale
Les techniques de séquençage utilisent des enzymes particulères : les ADN polymérases. Ces enzymes sont capables de synthétiser un brin complémentaire d'ADN, à partir d'un brin matrice :
figure 1. synthèse d'un brin d'ADN complémentaire du brin matrice
Ces réactions se font par ajout de désoxyribonucléotides (dNTP : désoxyNucléotide TriPhosphate). On utilise pour le séquençage des nucléotides légèrement différents : les didésoxyribonucléotides (ddNTP). Les ddNTP diffèrent des dNTP par l'absence d'un groupement OH bien précis :
http://www.snv.jussieu.fr/vie/dossiers/sequencage/figure2.gif
figure 2. deux types de nucléotides triphosphates
En effet, lorsqu'une ADN polymérase utilise un ddNTP au lieu d'un dNTP, elle n'est plus capable de rajouter le moindre nucléotide à sa suite : la synthèse du brin d'ADN s'arrète...
figure 3. synthèse d'un brin d'ADN après ajout d'un désoxynucléotide ou d'un didésoxynucléotide
Les techniques de séquençage se basent sur ces connaissances. On procède de la façon suivante : une ADN polymérase synthétise le brin complémentaire de l'ADN à séquencer. Dans le milieu de réaction se trouvent des dNTP en grand nombre, et une faible proportion d'un ddNTP (à Adénine, ou Guanine, ou Thymine, ou Cytosine). A un moment totalement aléatoire, un ddNTP sera ajouté à la chaîne en cours de synthèse par l'ADN polymérase. Cette synthèse s'arrêtera donc à cet endroit.
Par exemple, si le milieu réactionnel contient une faible proportion de didésoxyribonucléotide à Guanine (ddGTP), on obtiendra à la fin des réactions un ensemble de brins d'ADN de tailles variés, selon l'endroit où un ddGTP se sera inséré et que la réaction aura ainsi été stoppée (ce qui correpond, du fait de la complémentarité des bases, à la présence d'une Cytosine dans le brin d'ADN séquencé). On répète la même opération avec un milieu contenant du ddATP, un milieu contenant du ddCTP, et un milieu contenant du ddTTP.
http://www.snv.jussieu.fr/vie/dossiers/sequencage/figure4.gif
figure 4. l'utilisation d'un ddNTP permet d'obtenir un ensemble de fragments d'ADN de différentes tailles, correspondant aux emplacement d'un nucléotide donné
Il ne reste plus qu'à "lire" la séquence : on fait migrer tous ces fragments sur un gel, afin de les séparer selon leur taille. Au niveau d'une "ligne" du gel correspond une taille (précise au nucléotide près) du fragment d'ADN. Afin de lire les quatre nucléotides de l'ADN, on fait migrer séparément les fragments issus des quatre mélanges réactionnels (à ddATP, à ddCTP, à ddGTP et à ddTTP).
On peut alors lire la séquence (animation en boucle):
Pour voir un exemple de lecture de séquence d'ADN, cliquer ici (http://www.snv.jussieu.fr/vie/dossiers/sequencage/sequence.htm#).
II- Quelques points de technique...
Une ADN polymérase n'est pas capable de débuter une synthèse d'un brin d'ADN à partir de rien. Il lui faut partir d'un court fragment d'ADN, appelé une amorce. Cette amorce est un oligonucléotide de 15 à 25 nucléotides, complémentaire d'une séquence d'ADN connue, située juste en amont de l'ADN à séquencer :
http://www.snv.jussieu.fr/vie/dossiers/sequencage/figure5.gif
Les "réactions de séquence" (avec ddNTP) sont rapides (moins de 15 minutes). Le point long du protocole est en fait la lecture du résultat.
La plus vieille méthode, encore utilisée dans les séquençages "à la main" (voir au contraire l'automatisation ci-dessous) consiste en une migration de deux à quatre heures sur gel d'acrylamide. Il faut ensuite pouvoir "voir" les fragments d'ADN. Pour cela, certains des nucléotides utilisés sont marqués, soit par ajout d'une molécule florescente (sur l'amorce utilisée), soit par utilisation de nucléotides marqués radioactivement.
On "lit" donc la séquence soit en regardant la fluorescence, soit en exposant un film photographique au gel (après révélation, des bandes sombres apparaissent là où se trouvait de l'ADN : voir les exemples de résultats ci-desus, obtenus par cette méthode). La séquence lue est limitée à 200 - 300 nucléotides environ : au-delà, les bandes sont trop tassées... Leur ordre n'est plus déterminable...
III- L'automatisation du séquençage
La très grande majorité des séquences réalisées et publiées aujourd'hui sont réalisées sur des séquenceurs automatiques. Ceux-ci sont capables de réaliser les réactions de séquence, puis de les lire :
http://www.snv.jussieu.fr/vie/dossiers/sequencage/figure6.jpg
Pour cela, on marque les fragments d'ADN grâce à des marqueurs fluorescents. Une fois la réaction de séquence terminée, la taille des fragments obtenus est déterminée par une chromatographie. Le séquenceur détecte la florescence sortant des colonnes de chromatographie, repérant ainsi les fragments d'ADN et leur taille précise. Les systèmes les plus modernes permettent même de lire les quatres nucléotides à partir d'une seule colonne de chromatographie.
Le résultat est présenté par la machine sous forme de courbes présentant la fluorescence détectée, et l'interprétation qui en faite en terme de nucléotides. Pour exemple, voici un court extrait d'une telle courbe :
http://www.snv.jussieu.fr/vie/dossiers/sequencage/sequence.gif
un exemple de résultat de séquence automatique : les quatre courbes correspondent à la détection de la fluorescence des fragments d'ADN obtenus. Un "pic" correspond donc à la détection d'un nucléotide donné dans la séquence : l'interprétation est donnée sous les courbes.
En bleu : Adénine. En vert : Thymine. En jaune : Guanine. En rouge : Cytosine.
Les séquenceurs automatiques présentent de nombreux avantages : l'automatisation et l'utilisation d'une chromatographie au lieu d'une électrophorèse permet un gain de temps appréciable. Le coût de revient est bien moindre (une fois amorti l'investissement dû à l'achat de la machine). De plus, alors qu'on ne peut guêre espérer lire plus de 300 nucléotides de manière correcte lors d'un séquençage "à la main", les séquenceurs permettent de lire plusieurs centaines de nucléotides avec une très bonne qualité, jusqu'à 1000 pour les appareils les plus performants !
La seule limitation à l'utilisation de séquenceurs automatiques reste leur coût d'achat élevé, qui impose, concrêtement, la mise en place de services communs de séquençage dans les instituts de recherche.
ÑÖæÇä ÇáÍÈíÈ
2011-03-24, 11:51
ÇáãáÝ Úáì Ôßá pdf
http://www.dil.univ-mrs.fr/~vancan/optionBio1/documents/2emecours2003_4.pdf?#zoom=81&statusbar=0&navpanes=0&messages=0
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