خطوات دراسة بروتين
استخلاص البروتين
فصل البروتين عن المركبات الأخرى
فصل البروتين عن باقي البروتينات (التنقية)
تحديد مكونات البروتين من الأحماض الأمينية
تحديد تسلسل الأحماض الأمينية في البروتين
بلورة البروتين (تحويل البروتين إلى الصورة البلورية)
تحديد البنية الفراغية للبروتين
تحديد آلية العمل (الوظيفة).
ترسيب البروتينات
-1- الترسيب مع التخريب
* الحرارة المرتفعة
* الأحماض والقواعد القوية
* المذيبات العضوية
2- الترسيب بدون تخريب
* المذيبات العضوية القابلة للذوبان في الماء (الكحولات) في الحرارة المنخفضة
* الأملاح المتعادلة
* تغيير pH
3- تخريب بمواد كيميائية أخرى مثل اليوريا b – مركبتوإيثانول
الفائدة العملية لترسيب البروتينات:
فصل البروتينات عن باقي المركبات العضوية المكونة للمادة الحية
فصل جزئي للبروتينات عن بعضها البعض.
أهم طريقة مستعملة في المخابر لترسيب البروتينات بدون تخريب هي باستعمال المحاليل المشبعة للأملاح المتعادلة
لماذا الأملاح المتعادلة؟ لأنها لا تغير من درجة pH
ماهي أهم الأملاح المستعملة ؟ كبريتات الأمونيوم (NH4)2SO4 - وكبريتات المغنسيوم MgSO4
تأثير pH على ذوبان البروتين:
1- يترسب البروتين عند pHi
2- يكون البروتين عند أدنى قيمة من الذوبان عندما يكون pH المحلول=pHi للبروتين.
تخريب البروتين:
تخريب البروتين هو تغيير البنية الطبيعية للبروتين يتضمن ذلك تغيير البنية الثانوية أو الثالثية أو الرابعية أو كلها
لماذا تتغير البنية ؟ نتيجة لتكسير الروابط
ماهي أنواع الروابط التي تتكسر:
الهيدروجينية أساسا
الملحية
الكارهة للماء هذه الروابط غير مستقرة عند ارتفاع الحرارة
أهم حالة ندرسها هي التخريب بالحرارة
العوامل التي تؤثر على التخريب بالحرارة:
المحتوى المائي حيث يكون البروتين الجاف أكثر مقاومة للحرارة ، بعض البروتينات يمكنها المحافظة على بنيتها عند 100 °م عندما يكون محتوى البروتين من الماء منخفضا
وجود الأملاح والسكريات حيث تعمل السكريات مثل الجلوكوز وخاصة السكروز رفع درجة الحرارة التي يتم فيها تخريب البروتين (رفع المقاومة للحرارة)
كما يؤثر نوع الأحماض الأمينية في زيادة ثبات البروتين تحت تأثير الحرارة حيث أن وجود نسبة مرتفعة من بعض الأحماض الأمينية الكارهة للماء مثل Val و Leu و phe و Ile
يمكن تخريب البروتين بتكسير الجسور الكبريتية (مثال: إنزيم الريبونيوكلياز.
أهمية هذه الظاهرة (الثبات الحراري للبروتين):
بعض الكائنات الدقيقة يمكنها العيش في درجات حرارة مرتفعة جدا قد تصل في إلى الغليان (100°م) أو حتى أعلى من ذلك في أعماق المحيطات على مقربة من البراكين الثائرة.- البكتريا المقاومة للحرارة thermophyles
اكتشفت مؤخرا بكتريا تعرف بأنها فائقة المقاومة للحرارة Superthermophyles
السؤال المطروح: كيف يمكن للبروتينات والإنزيمات العمل تحت هذه الظروف ؟ هل هي بروتينات خاصة أم هي هي نفس البروتينات؟
الإختبارات التي أجريت على هذه الإنزيمات خارج الخلية تشير إلى أن هذه الإنزيمات تحافظ على نشاطها عند درجات الحرارة المرتفعة. - هناك تطبيقات صناعية كثيرة جدا لهذه الإنزيمات.
يتم تخريب البروتين بـ:
وضعها في مذيب عضوي الذي يغير الروابط الكارهة للماء.
العوامل الكيميائية التي تؤثر على الروابط الهيدروجينية ، الشاردية ، الجسور الكبريتية.
الحرارة المرتفعة التي تكسر الروابط الضعيفة.
البنية الفراغية للبروتينات:
لكل بروتين بنية فراغية محددة بدقة متناهية ، هذه البنية هي المسؤولة عن وظيفة هذا البروتين. أي تغير في البنية الفراغية يؤدي إلى فقدان الوظيفة.
يبدأ الحديث عن بنية البروتين عند تكون السلسلة الببتيدية أي بعد تكوين الروابط الببتيدية.
البنية الأولية: هي ارتباط عدد من الأحماض الأمينية بروابط ببتيدية
نوع واحد من الروابط بين الأحماض الأمينية
لا يوجد حديث عن الالتفاف (أبسط بنية)
البنية الأولية هي تتابع أو تسلسل الأحماض الأمينية.
البنية الثانوية: هي إلتفاف السلسلة الببتيدية ذات البنية الأولية في مناطق محدودة في شكل بنية حلزونية a أو أوراق مطوية b أو مناطق انعطاف.
وجود نوع جديد من الروابط هو الروابط الهيدروجينية بين مجموعات C=O ومجموعات N-H التابعة للروابط الببتيدية
مناطق الإنعطاف
هي مناطق لا تأخذ البنية a ولا البنية b ويمكن أن نجد منها نوعان:
مناطق انعطاف طويلة وذات أشكال غير محددة وتتواجد بين البنيات a أو بين a و b .
إنعطاف b وتتواجد بين بنيتين ثانويتين من نوع b المتعاكسة وتأخذ شكلا محددا. طولها لا يتعدى 5 أحماض أمينية (غالبا أربعة) وتحتوي على رابطة هيدروجينية n+3 .
البنية الثالثية:
هي التفاف لعدد من البنيات الثانوية لسلسلة ببتيدية واحدة تفصلها مناطق انعطاف. وقد تكون البنيات الثانوية كلها a أو كلها b أو خليط من a + b،
تحافظ البنية الثالثية على استقرارها بواسطة 4 أنواع من الروابط : كبريتية ، شاردية ، كارهة للماء وهيدروجينية بين المجموعات الكيميائية الموجودة في الجذور.
البنية الرابعية:
هو تجمع سلستين ببتيديتين أو أكثر لكل منها بنية ثالثية تسمى كل سلسلة ببتيدية داخل البنية الرابعية باسم تحت الوحدة sous unité.
تحافظ البنية الرابعية على استقرارها بواسطة روابط غير تساهمية كارهة للماء أساسا بالإضافة إلى روابط شاردية وربما هيدروجينية كذلك. لا وجود للروابط التساهمية بين تحت الوحدات، قد تكون البنية الرابعية متجانسة إذا كانت السلاسل الببتيدية (تحت الوحدات) متشابهة
أو تكون غير متجانسة إذا كانت تحت الوحدات غير متشابهة حتى ولوكان بعضها متشابه كما في حالة الهيموجلوبين a2b2 أو إنزيم ATP synthéase
قواعد هامة في انطواء البروتين:
من بين القواعد الهامة في انطواء البروتين المحب للماء مثل الهيموجلوبين والميوجلوبين والبيومين البيض وإنزيم الليزوزيم هو تواجد الأحماض الأمينية المحبة للماء على سطح البروتين وتواجد الأحماض الأمينية الكارهة للماء في داخل (قلب) الجزيء.
القاعدة: أحماض أمينية محبة للماء على السطح ، والأحماض أمينية الكارهة للماء في الداخل.
أي خلل في هذه القاعدة قد تؤدي إلى خلل في عمل البروتين ومرض وراثي مثل مثال: مرض الأنيميا المنجلية.